新生儿破伤风诊断主要依靠典型独特的临床表现和接生过程消毒不严史或分娩过程新生儿局部外伤未经消毒史。诊断标准有条件可做病原学检查。
1、标本采取：
于脐部未进行消毒处理和注射破伤风抗毒素之前，用无菌棉棒于脐部化脓部位深处取脓汁及坏死组织，至少应同时取两份标本，一份用做涂片镜检，另一份做动物试验。
2、直接镜检：
取上述标本直接涂片，革兰氏染色后镜检，观察菌体的大小、形态及特征，菌体长2～5μm，宽0.4～0.5μm，两端钝圆，无荚膜。本菌为革兰氏阳性细菌。鞭毛染色镜检，可见周身鞭毛。
3、分离培养：
破伤风杆菌为专性厌氧菌，需在厌氧培养设备(厌氧箱、厌氧罐或厌氧袋)中处理标本。将标本分别接种于数管肉渣汤及牛乳培养基上加盖凡士林，然后取其中1～2管加热80℃10min以杀死无芽孢菌。其余各管不加热，皆放在37℃孵育，观察细菌生长情况，做涂片染色镜检。
在37℃培养的标本，48h后即能生成芽孢，成熟的芽孢为正圆形，未成熟的芽孢为卵圆形，芽孢较菌体直径大，芽孢位于菌体的顶端将菌体膨胀呈鼓槌状。
另将标本涂于血琼脂平皿上(培养基中加适量新霉素以遏制杂菌生长)行厌氧培养，挑取菌落进行生化反应鉴定。
4、生化反应鉴定：
葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖发酵(分解)试验均阴性。不分解糖类但能形成吲哚。牛乳消化试验阴性;水杨苷发酵试验阴性;硝酸盐还原试验阴性;触酶试验阴性;甲基红试验阴性;美蓝试验阴性;甲基乙酰甲醇(V.P)试验阴性;甘露糖发酵阴性;甘露醇发酵阴性;脂酶发酵阴性;卵磷脂酶阴性;产生吲哚;明胶水解(液化)试验阳性。
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