狂犬病的诊断技术有什么呢

　　狂犬病又名恐水症，是由狂犬病毒所致的自然疫源性人畜共患急性传染病。流行性广，病死率极高，几乎为100%。⑴对人民生命健康造成严重威胁。人狂犬病通常由病兽以咬伤的方式传给人人体而受到感染。临床表现为特有的恐水、恐声、怕风、恐惧不安、咽肌痉挛、进行性瘫痪等。

　　1　范围

　　本标准规定了狂犬病内基氏小体(negribodies)检查、免疫荧光试验、小鼠和细胞培养物感染试验的技术要求。

　　本标准适用于各种易感动物的狂犬病的诊断和检疫。

　　2　内基氏小体检查

　　2.1　准备

　　2.1.1　器材

　　胶皮手套、口罩、防护眼镜等个人防护器具;骨锯、骨凿、骨剪、脑刀等动物解剖器具;切片机、染色缸等组织制片与染色器具;光学显微镜等。

　　2.1.2　标本保存液

　　10%(体积分数)福尔马林溶液，50%(体积分数)甘油生理盐水。

　　2.1.3　染色液

　　赛勒(Seller)氏染色液，曼(Mann)氏染色液，其配制方法见附录A(标准的附录)。

　　2.1.4　人身防护

　　2.2　样品的采集和运送

　　2.2.1　对可疑为狂犬病而扑杀或死亡的动物(含实验感染小鼠)，应在死亡后3h内(越早越好)由大脑海马回(Ammon氏角)、小脑皮质和延髓各切取lcm3组织数块，放人灭菌玻璃瓶，再置于冰瓶内于24h内送达实验室。

　　2.2.2　不能立即送检者，应加10%福尔马林溶液固定，或加50%甘油生理盐水，4℃保存送检。

　　2.2.3　不能就地取脑时，小动物可送检完整的新鲜尸体，大动物可送检未剖开的头颅。

　　2.3　标本片的制备

　　2.3.1　对新鲜脑组织，可用外科刀切开，以通过火焰去脂的载玻片在其切面上触压一下制成压印片。每张载玻片可接触2～3个部位，每份材料做3～4张。

　　2.3.2　在甘油盐水中保存的新鲜病料，应先用生理盐水彻底洗去甘油，方可制片，制片方法同2.3.1。

　　2.3.3　所有压印片于室温下干燥后，浸入甲醇溶液固定2min。

　　2.3.4　经10%福尔马林溶液充分固定过的脑组织可按常规方法制备组织学切片。

　　2.4　染色

　　2.4.1　赛勒氏染色法

　　在经过甲醇固定并风干的压印片上，滴加赛勒氏染色液(以盖满压印面而不温为度)着染5s～10s，然后用蒸馏水冲洗，干燥后镜检。

　　2.4.2　曼氏染色法

　　2.4.2.1　将经过甲醇固定并风干的压印片，或者经过脱蜡、浸水、风干的切片浸入曼氏染色液中浸染。压印片浸染5min，切片浸染时间因温度而异(室温下24h，或38℃温箱中12h，或60℃温箱中2h)。

　　2.4.2.2　以蒸馏水快速洗去染色液，至无浮色出现为止，用吸水纸吸干。

　　2.4.2.3　以无水乙醇稍洗，至标本区刚出现蓝色为度。

　　2.4.2.4　浸入碱性乙醇分化15s～20s，至标本区出现红色。

　　2.4.2.5　依次通过无水乙醇和蒸馏水各数秒钟，分别洗上氢氧化钠和乙醇，再浸入微酸性水中lmin～2min。酸化期间，经常于显微镜下观察，至细胞核出现蓝色为宜;如果核蓝色过深，说明酸化过度，可退回至碱性乙醇，再作短时分化。

　　2.4.2.6　以蒸馏水水洗后，依次通过95%乙醇和无水乙醇脱水，并经二甲苯透明，最后加香胶封固。

　　2.5　显微镜检查及判定

　　内基氏小体嗜酸性，位于神经细胞胞浆中，呈圆形、椭圆形或棱形，直径3um～20um，一个细胞内通常含有一个内基氏小体，但也可含有几个。用赛勒氏染色时，内基氏小体呈桃红色，神经细胞为蓝紫色，组织细胞为深蓝色。用曼氏染色时，内基氏小体为鲜红色，神经细胞的胞核为蓝色、胞浆为淡蓝色，红细胞为粉红色。有时，在鲜红色的内基氏小体中还可以见到嗜碱性的蓝色小颗粒。

　　内基氏小体即狂犬病包涵体，为狂犬病所特有。因此，一旦检出内基氏小体，即可确诊。但在检查犬脑时，应注意与犬瘟热病毒引起的包涵体相区别。犬瘟热包涵体主要出现于呼吸道、膀胱、肾盂、胆囊、胆管等器官粘膜上皮细胞的胞浆和胞核内。在脑组织内，见于原浆细胞和一些小胶质细胞的核内，在神经原内很少见到。

　　3　免疫荧光试验

　　3.1　材料准备

　　3.1.1　器材

　　荧光显微镜，恒温箱，载玻片(片厚2mm以下)，盖玻片，冰冻切片机。

　　3.1.2　试剂

　　3.1.2.1　异硫氰酸荧光黄(FITC)标记抗狂犬病病毒丙种球蛋白(以下简称狂犬病荧光抗体)和未标记抗狂犬病病毒丙种球蛋白(以下简称狂犬病未标记抗体)，由制标单位提供。使用时，用0.02%伊文思蓝(Evansblue)染色液稀释成2～4个染色单位。例如，荧光抗体染色效价为1：64，则作1：32～1：8稀释后使用。

　　3.1.2.2　丙酮(分析纯)使用前置普通冰箱内预冷至4℃左右。

　　3.1.2.3　0.01mol/L pH7.4磷酸盐缓冲盐水(PBSS)。

　　3.1.2.4　0.02%伊文思蓝染色液。

　　3.2　样品的采取和运送

　　同2.2。

　　3.3　标本片的制备

　　3.3.1　病料标本片制备

　　3.3.1.1　按照2.3的方法和要求制得压印片，也可由切面刮取脑细胞泥均匀涂成直径约lcm的圆形涂抹面，或者参照常规方法将被检脑组织制成厚度在5um～8um的冰冻切片。

　　3.3.1.2　标本片于空气中自然干燥，在冷丙酮中固定4h或过夜，然后在冷磷酸盐缓冲盐水中轻轻漂洗，取出后干燥，在标本区周围用记号笔划圈，立即染色检查，或密封于塑料袋中，置-20℃暂时保存。

　　3.3.2　细胞培养物标本片制备

　　接种了被检病料的细胞培养物(如神经母细胞瘤细胞)，继续在二氧化碳恒温箱中培养48h，随后用橡皮刮子刮取细胞泥在载玻片上制成薄而均匀涂片。当以盖玻片为载体生长的细胞培养物时，则可直接取此长满细胞单层的盖玻片作为标本片。然后按3.3.1.2风干、固定和保存。

　　3.4　染色

　　3.4.1　用吸管吸取稀释的狂犬病荧光抗体，滴加1～2滴于经丙酮固定的标本片上，使其布满整个标本区。

　　3.4.2　将标本片置于搪瓷盘内(盘底垫以浸湿的纱布，纱布上放玻片架)，放37℃恒温箱内着染30min。

　　3.4.3　取出玻片，用磷酸盐缓冲盐水轻轻冲去玻片上多余的染色液，再将玻片连续通过3缸(或杯)磷酸盐缓冲盐水，每缸浸泡3min，并不时轻轻振荡。最后在蒸馏水中浸泡3min。

　　3.4.4　在吸水纸上轻轻磕尽玻片上的蒸馏水，自然干燥后，于标本区上滴加1滴甘油缓冲液(分析纯中性甘油9份，pH7.4磷酸盐缓冲盐水11份)，覆盖玻片扣于载玻片上，然后镜检。

　　3.5　对照设置

　　3.5.1　已知狂犬病病毒标本片加狂犬病荧光抗体染色应有特异荧光出现。

　　3.5.2　已知狂犬病病毒标本加狂犬病未标记抗体阻抑后，再加狂犬病荧光抗体染色，应无特异荧光出现。

　　3.5.3　已知狂犬病病毒阴性标本片加狂犬病荧光抗体染色，应无特异荧光出现。

　　3.6　荧光显微镜检查及判定

　　一般用蓝紫光，激发滤光片用BG12 ：，吸收滤光片用OG1或GG9，以满足异硫氰酸荧光黄的荧光谱要求为准。暗视野聚光器比明视野聚光器易于观察特异性荧光。物镜浸油须用无荧光镜油，也可以封片用的甘油缓冲液代替。先检查对照标本。只有在对照标本的染色结果符合3.5.1—3.5.3要求时才能去检查被检标本。特异性荧光呈亮绿至黄绿色，背景细胞染成淡黄或橙红色，细胞核成暗红色。狂犬病特异性荧光颗粒较大，数量不等，位于细胞浆内。凡在神经细胞胞浆内发现特异性荧光，均应判为狂犬病病毒感染者。

　　4　小鼠和细胞培养物感染试验

　　4.1　材料准备

　　4.1.1　器材：细胞培养瓶(或管)，二氧化碳恒温箱，微量超滤器(滤膜孔径0.45um)，微量组织研磨器，普通离心机及离心管，0.25mL注射器及针头等。

　　4.1.2　试剂：0.5%水解乳蛋白汉克氏(Hanks)液，伊格尔氏(Eagle)最低要素培养液(EMEM)，犊牛血清，20000IU/mL青霉素溶液，20000ug/ mL链霉素溶液等。

　　4.1.3　小鼠：无特定病原(SPF)易感小鼠，5～7日龄(也可用3～4周龄者，但发病时间可能稍推迟)。

　　4.1.4　仓鼠肾传代细胞(BHK21)或小鼠神经母细胞瘤(NACl300)细胞。

　　4.2　样品的采取和运送

　　除可按照2.2的方法和要求送检新鲜脑组织外，还应采集唾液送检。方法是：用灭菌吸管吸取或用灭菌棉拭棒蘸取腮腺口附近的唾液，置入lmL～2mL内含2%灭活豚鼠血清和抗生素的Hanks液中，低温保存备用。

　　4.3　样品的处理

　　脑组织用组织研磨器磨碎，加0.5%水解乳蛋白Hanks液制成20%(m/V)混悬液，以3000r/min离心30min，吸取上清液，加入青霉素500IU/mL和链霉素500ug/mL，在4℃处理3h～4h，即可用于感染小鼠和细胞培养物的接种样品。唾液样品亦需经上述离心和杀菌处理。怀疑有污染的样品，可用0.45um微孔滤膜过滤法处理。

　　4.4　感染方法

　　4.4.1　小鼠感染法

　　每份样品用小鼠4～6只。左手固定小鼠，在耳与眼之间用碘酒消毒。右手持吸取接种样品的0.25mL注射器在消毒部位刺人硬脑膜下，每只小鼠注射0.03mL。对照小鼠2只，按同法同剂量注射稀释液(即0.3%水解乳蛋白Hanks液)。每天早晚各观察1次，记录是否有发病小鼠。至少观察28d。

　　4.4.2　细胞培养物感染法

　　每份样品接种4～管细胞培养物。取接近长成单层的细胞培养物用Hanks液轻洗3次，每管接种样品0.1mL～0.2mL，在37℃恒温箱内吸附1h，用Hanks液洗1次(亦可不洗)加人含有1%～2%犊牛血清的EMEM液(添加量随细胞瓶大小而定)，放二氧化碳恒温箱(37℃)内继续培养。同时设细胞对照2管，以0.5%水解乳蛋白Hanks液替代样品上清液。每天观察1次，记录是否有致细胞病变作用(CPE)出现。至少观察15d。

　　4.5　感染性鉴定

　　4.5.1　小鼠感染性鉴定

　　若对照小鼠健活，而样品接种小鼠在接种后4d～7d开始发病，呈现痉挛、麻痹等神经症状并死亡，可确诊为狂犬病感染者。如果症状不典型，可扑杀取脑，采用内基氏小体检查或免疫荧光试验鉴定之。如果7d后不发病，可将其中2只小鼠放血致死，取脑作成10%(m/V)混悬液，接种健鼠盲目传代;第2代在7d左右还不发病时，再盲传1代;至第3代经4周观察仍不发病时，可报告狂犬病小鼠感染试验阴性。对观察期间死亡的小鼠，应进行内基氏小体检查或免疫荧光检查以鉴别之。

　　4.5.2　细胞培养物感染性鉴定

　　若对照细胞培养物正常，而样品接种的细胞培养物不论是否出现细胞病变，但经免疫荧光试验证实有特异性荧光时，可确诊为狂犬病感染者。为缩短检验时间，可在接种后48h抽取1—2管细胞培养物进行免疫荧光试验。对既无细胞病变又无特异性荧光反应者，应再盲传2次。第3代经15d观察仍无细胞病变和特异性荧光时，可报告狂犬病细胞培养物感染试验阴性。