门静脉高压症脾脏及其巨嗜细胞的研究

　　目的：从观察脾脏巨噬细胞的变化入手,进一步探讨门静脉高压症脾功能亢进的发病机制,为最终了解门静脉高压症脾脏的变化及评价其免疫功能状况、临床上对门静脉高压症脾脏是应该"切"还是应该"留"提供实验依据。

　　方法：以门静脉高压症手术切除的脾脏为研究对象,并与正常人外伤脾的手术切除标本进行对照.采用HE染色、免疫组化、透射电镜、细胞培养、蛋白芯片、基因芯片等方法,从组织、细胞及其信号通路、蛋白、基因等不同层面,对门静脉高压症脾脏的组织形态、细胞因子表达差异、巨噬细胞超微结构、巨噬细胞的数量、巨噬细胞的吞噬功能、巨噬细胞表面Toll样受体表达、巨噬细胞的基因表达差异等进行了系列研究.另外,为了配合本实验研究,还探索了人脾脏巨噬细胞分离与纯化及其总RNA的提取方法.

　　结果1.与正常人脾脏比较,门静脉高压症脾脏的变化如下:①.组织形态:门静脉高压症脾脏,脾窦充血扩张,脾窦样结构增多及红髓面积明显增大致细胞密度相对减少;脾脏脾小体、红髓、边缘区内单位面积的Mψ数量较正常减少(相对数量),尤以脾小体和红髓更为明显.Mψ主要分布于脾小体和动脉周围淋巴鞘(正常脾脏Mψ主要分布在脾小体和红髓).②.巨噬细胞超微结构:门静脉高压症脾脏,Mψ表面伪足明显增多、增长,胞内溶酶体数量增多,吞噬红细胞、血小板的数量明显增多;Mψ内酸性磷酸酶(ACP)含量较正常脾脏明显增多,尤以红髓和边缘区内的Mψ更为明显,说明红髓和边缘区的Mψ吞噬功能明显增强.③.巨噬细胞的一定数量:虽然单位重量脾脏组织内Mψ的数量,门静脉高压症组较正常组减少(相对数量),但由于门静脉高压症时脾重量比正常脾重3.5～6倍(P<0.01),门静脉高压症脾脏Mψ的总数明显增多(一定数量).④.巨噬细胞的吞噬功能:鸡红细胞吞噬法检测Mψ的吞噬功能,脾脏Mψ吞噬率和吞噬指数:门静脉高压症组均显著高于正常组,且外周血白细胞和血小板计数均与脾Mψ的吞噬率和吞噬指数负相关.⑤.巨噬细胞表面Toll样受体表达:门静脉高压症脾MψTLR4表达量显著增多、Mψ吞噬功能显著增强,门静脉高压症患者血清内毒素水平明显升高,且三者之间呈显著正相关.⑥.巨噬细胞的基因表达:应用3张含有14112点cDNA的Biostar-H140scDNA表达谱芯片分别检测到门静脉高压症脾Mψ与正常脾脏Mψ之间分别有896、1330和898个差异表达基因,恒定的差异表达基因共有121个,占总基因数的0.86.其中表达上调的已知基因有21个,表达下调的已知基因有73个.差异表达基因涉及离子通道和运输蛋白、细胞周期蛋白类、细胞骨架和运动、细胞受体、细胞信号和传递蛋白、代谢、免疫相关等多个方面.这些基因可能与PHT脾亢的发病机制有关.⑦.脾脏组织细胞因子的表达:应用可同时检测79个细胞因子的蛋白质芯片检测门静脉高压症脾组织与正常脾脏组织的细胞因子表达差异,发现79个细胞因子中,共有26个在两组间的表达呈现明显差异。