艾滋病诊断及鉴别诊断

　　一、　诊断依据：

　　(一)　 流行病学及临床表现

　　(二)　 实验室检查

　　(1)　 主要是中度以上细胞免疫缺陷包括：CD4+T 淋巴细胞耗竭：T淋巴细胞功能下降，外周血淋巴细胞显著减少，CD4<200/μl，CD4/CD8<1.0，(正常人为1.25～2.1)，迟发型变态反应皮试阴性，有丝分裂原刺激反应低下。

　　(2) B淋巴细胞功能失调：多克隆性高球蛋白血症，循环免疫复合物形成和自身抗体形成。

　　(3) NK细胞活性下降

　　(4)各种致病性感染的病原体检查如PCR。组织学证实的恶性肿瘤，如KS;

　　(三)HIV抗体检测

　　1.酶联免疫吸附法(ELISA);2.明胶颗粒凝集试验(PA);3.免疫荧光检测法(IFA);4.免疫印迹检测法(Western Blot，简称WB法);5.放射免疫沉淀法(RIP)。其中前三项常用于筛选试验，后二者用于确证试验。HIV感染后数周或数日内常不能检出抗体，95%的受染者在5个月内可测出抗体。但也有感染后3-4年仍不能检出抗体者，此时有必要检测HIV病毒。

　　(四)PCR技术检测HIV病毒

　　1.标本的采集与模板核酸的制备。从怀疑为AIDS和ARC患者以及无症状的彩虹恋者采集血液标本，分成两份，其中一份送往检测实验室与Glyciegel混合进行常规检验或者在-20～-80℃保存。另一份可在冻存之前通过聚蔗糖(Ficoll)离心分离，收集沉积细胞。此法亦适用于疑为HIV感染的母亲及出生6个月以上的新生儿的血液标本。

　　可采用下述方法自血液标本中分离外周血单核细胞(PMC)：

　　① 取4ml血液用Hanks液1：1稀释。

　　② 向含有1份淋巴细胞分离液的试管内轻轻加入两分稀释的血液，勿搅乱分层。

　　③ 2500r/min离心20min。

　　④ 吸出介于淋巴细胞分散液和血浆层间的PMC层，再用Hanks液洗两遍。

　　⑤ 加入RPMI-1640生长液(10%胎牛血清，10%白介素-2，2μg/ml polyberen 及2.5μg/ml的植物血凝集素P),使细胞浓度为2×106/ml。

　　⑥ 置5%CO2的孵箱内于37℃培养2～3d，作为HIV分离的靶细胞。

　　2.模板核酸的提取。制备PCR模板核酸有多种方法，但其基本原理大致相同，使用的试剂因采取的方法不同而异。这里分别介绍两种从外周血单核细胞中提取DNA和RNA的方法。

　　(1)从外周血单核细胞中提取DNA

　　方法A：

　　① 取1ml经37℃快速解冻的Glyciegel冻存细胞置一支小离心管内。

　　② 加入2ml含有10%胎牛血清的RPMI-1640溶液洗一次。

　　③ 2500r/min离心10min，弃上清。

　　④ 沉淀的细胞用PBS洗两次，最后将细胞悬浮在溶液A(100mmol/KCl，10mmol/LTris-HCl，pH8.3)中，使细胞浓度为6×106/ml。

　　⑤ 加入等体积的溶液B(10mmol/LTris-HCl，pH8.3，2.5mmol/L MgCl2，10%Tween20，10%NP-40)。

　　⑥ 于37℃保湿后置冰箱保存。

　　该方法也适用于无Glyciegel保存的肝素标本及新鲜样品经聚蔗糖-400离心制备的淋巴细胞DNA的提取。

　　方法B：

　　① 取4ml经37℃快速解冻的Glyciegel标本。

　　② 2500r/min离心10min，收集沉淀的细胞，上清液可作血清学研究用。

　　③ 用10ml0.9%NaCl(含50%葡萄糖)将沉淀的细胞洗一次。

　　④ 再用10ml 0.9%NaCl(含50%葡萄糖)洗两次。

　　⑤ 通过聚蔗糖-400离心，分离单核细胞。

　　⑥ 将单核细胞悬浮于0.5ml裂解缓冲液(10mmol/L，Tris-HCl pH8.3，10mmol/L EDTA，10mmol/L NaCl，0.5%SDS，100μg/ml蛋白酶K)中使细胞裂解。

　　⑦ 用酚一氯仿抽提两次，将水相转移到一支新的离心管内。

　　⑧ 加入3倍体积的无水乙醇，于-20℃放置20min，13000r/min离心10min，弃上清，沉淀物经真空干燥后，用100μl蒸H2O溶解，于-20℃保存。

　　该方法也适用于标本经聚蔗糖-400离心制备的单核细胞DNA的提取。

　　(2)从外周血单核细胞中提取RNA及其反转录

　　方法A：

　　① 5ml血液标本，通过聚蔗糖-400离心制备外周血单核细胞。

　　② 将细胞悬浮于10mlRPMI-1640离心制备外周血单核细胞。

　　③ 2500r/min离心20min，收集沉积细胞。

　　④ 把细胞悬浮于一定体积的预冷的裂解缓冲液(0.4mmol/L NaCl，10mmol/L Tris-HCl，pH8.3，1.5mmol/L MgCl2,0.5% NP-40)中,使细胞浓度为104/ml。

　　⑤ 13000r/min，于4℃离心10min，收集上清液。

　　⑥ 把含有RNA的上清液转移到一支新管内，立即置-80℃保存，备用。

　　在RNA反转录前，先将RNA样品用DNase处理，除去样品中残留的DNA。经反转录得到的cDNA即可进行PCR扩增。RNA反转录操作如(7)～(9)。

　　⑦ 取10μlRNA样品加2.7U DNase I。

　　⑧ 于37℃保温10min,93℃10min,立即放入冰浴中冷却。

　　⑨ 另将一份DNase I处理过的RNA样品，加入RNase A(15μg/份)，37℃保温10min，置-20℃保存。

　　方法B：

　　① 取5ml新鲜血浆置一支离心管内。

　　② 40000r/min，4℃离心10min，收集沉淀。

　　③ 将沉淀物溶于变性液(4.0mmol/L异硫氰酸胍,25mmol/L柠檬酸缓冲液pH7.0,0.5 sarcosyl,0.1mmol/L2-巯基乙醇)中充分混匀.

　　④ 加入30μl2mmol/L乙酸钠缓冲液pH4.2,400μl酚和80μl氯仿/异戊醇混合液(24:1),萃取1min,冰上放置20min.

　　⑤ 13000r/min离心20min.

　　⑥ 轻轻将水相转移到一支新管中.

　　⑦ 加入3倍体积的无水乙醇,-20℃放置1h左右.

　　⑧ 13000r/min,4℃离心15min,收集沉淀.

　　⑨ 沉淀物用75%乙醇洗涤两次,真空干燥.

　　⑩ 加入10μl 水溶解,立即置-80℃保存或者反转录.

　　⑾ 取10μl RNA样品.

　　⑿ 加入10μl 1×PCR缓冲液(50mmol/L NaCl，10mmol/L Tris - HCl，pH 8.3,1.5mmol/L MgCl2 0.01%明胶),各0.2mmol/L四种dNTP,10pmol/GN GHD QLP GX PUH R XHH TR 39,20URNA酶遏制剂(RNsin),10U的AMV逆转录酶。

　　⒀ 42℃保温30～60min,然后93℃5min.

　　⒁ 立即置冰浴中冷却，备用。

　　由上述方法制得的RNA反转录样品，通过10%聚丙烯酰胺凝胶电泳可鉴定其特异性。

　　三、PCR扩增步骤

　　(一)引物的设计与合成

　　HIV PCR引物设计应遵寻引物设计的一般原则。由于HIV基因易发生变异，因而引物应在保守区内设计，一般在pol、evn、gag、tat基因中的核酸序列内设计，HIV感染的细胞往往很少，要从106个正常细胞中检出1个HIV感染细胞，PCR扩增的引物首先要具有特异的结合HIV相应基因能力，同时一般要采用巢式-PCR方法，来提高检测的灵敏性。

　　检测HIV引物的第二步骤就是扩增HIV感染细胞中的原病毒DNA。感染细胞与未感细胞混合得到连续的10倍感染细胞的稀释液。通常由103/106个感染细胞稀释至1/106个感染细胞。同时用其它逆转录病毒感染细胞的DNA作对照，进行PCR扩增。然后通过Southern杂交及DNA序列分析，进一步确定扩增产物的特异性。

　　已经被确定的保守区是gag，tat，evn，pol基因中的某些核苷酸序列。在用于临床标本检测之前，要对引物的特异性进行鉴定。通常取100pg含有HIV基因组序列的质粒DNA稀释液和2μg载体鲱鱼精DNA。如引物是特异的，它们就会指导单一的双股DNA片段的合成。合成的DNA片段相对应于两引物5′末端之间距离。如果是另一种DNA模板，就不会合成任何DNA片段。如果合成的DNA片段不是所预期的或除了有所预期的片段还有其它的DNA片段，那么可以考虑对PCR的条件进行某些改进，看是否能改善其特异性，否则要另选引物。